Rosa von Praunheim wurde 1942 während der deutschen Besatzung im Zentralgefängnis in Riga geboren. Er wuchs unter dem Namen Holger Mischwitzky bei seinen Adoptiveltern im brandenburgischen Teltow-Seehof in der DDR und nach der Flucht der Familie ab 1953 im Rheinland, später in Frankfurt am Main, auf. Sein Künstlername Rosa von Praunheim ist sowohl eine Reminiszenz an den Rosa Winkel, das stigmatisierende Zeichen, das Homosexuelle in den Konzentrationslagern der Nationalsozialisten tragen mussten, wie an den Namen des Frankfurter Stadtteils Praunheim, in dem er seine Jugend verbrachte.  

In den 1960er Jahren debütierte Rosa von Praunheim mit Experimental- und Kurzfilmen, die von Avantgardefilmern wie Gregory Markopoulos und Andy Warhol inspiriert waren. Mit Werner Schroeter drehte er 1968 den Kurzfilm Grotesk – Burlesk – Pittoresk, in dem dessen Muse Magdalena Montezuma ihre erste Hauptrolle spielte. von Praunheim zählt weltweit zu den produktivsten schwulen Filmemachern. Mit seinem Dokumentarwerk Nicht der Homosexuelle ist pervers, sondern die Situation, in der er lebt wurde er 1970 zum öffentlichen Wegbereiter der modernen Schwulenbewegung. Für den Dokumentarfilm über die Underground-Sängerin Tally Brown, Tally Brown, New York, wurde er 1979 mit dem Bundesfilmpreis ausgezeichnet. In seinen Spielfilmen machte von Praunheim immer wieder ältere vitale Frauen zu Stars, unter ihnen seine Tante Luzi in dem Kultfilm Die Bettwurst (1970) und Lotti Huber in Anita – Tänze des Lasters (1987) und Affengeil (1990). 

In der AIDS-Trilogie Schweigen = Tod (1989), Positiv (1990) und Feuer unterm Arsch (1990) prangerte er die Diskriminierung von AIDS-Kranken an und kämpfte für Hilfe und Aufklärung. Seine Aktion, mit der er 1991 in einer Talkshow schwule Fernsehprominente outete, war als „Verzweiflungsschrei eines Aids-Aktivisten" (Praunheim) gemeint und blieb heftig umstritten, führte jedoch langfristig zu mehr gesellschaftlicher Akzeptanz für Homosexuelle. Der Dokumentarfilm Die Jungs vom Bahnhof Zoo über die Berliner Stricher-Szene wurde 2012 mit dem Grimme-Preis ausgezeichnet. 

In zahlreichen Dokumentar- und Spielfilmprojekten arbeitete Rosa von Praunheim mit der Kamerafrau Elfi Mikesch zusammen, die nicht erst seit ihrem gemeinsamen Fotoroman Oh Muvie (1969) eine enge, bei aller Individualität gegenseitig befruchtende Künstlerfreundschaft mit ihm wie auch mit Werner Schroeter lebte. Rosa von Praunheim ist neben seiner Karriere als Filmemacher und Aktivist auch als Maler, Autor und Poet des automatischen Schreibens tätig. Wie Elfi Mikesch und Werner Schroeter ist Rosa von Praunheim Mitglied der Sektion Film- und Medienkunst der Akademie der Künste, Berlin, der er seit 2015 als Direktor vorsteht.